摘要：隨著水產養殖業的高速發展，魚粉資源緊缺，價格持續攀升，使得植物蛋白質源在水產飼料中的占比逐漸增大，但是植物蛋白質源含有的抗營養因子導致飼料利用率低下，并對水產動物健康造成不利影響。近年來，大量研究表明，發酵飼料可增強飼料的適口性，有助于提高水產動物對飼料中蛋白質、氨基酸、小肽和糖類等營養物質的利用率，并且生物發酵技術可降低植物蛋白質源中的抗營養因子，增加飼料中營養物質含量，提高水產動物機體健康水平和免疫力。本文主要論述發酵飼料的作用機理、主要的發酵菌種、發酵飼料在水產養殖中的應用以及存在的不足之處與前景展望，以便為發酵飼料在水產養殖中的應用提供參考。
水產養殖有著悠久的歷史，始于2000多年前的中國。目前我國的水產養殖產量占世界水產養殖產量的近68%。根據統計年鑒，2022年我國淡水養殖的產量已達到3406.38萬t，為人類提供了大量的優質動物蛋白質，改善了人們的食物結構。隨著集約化水產養殖的發展，養殖水環境污染和養殖動物疾病爆發等問題日益突出，嚴重的甚至導致養殖動物死亡，造成經濟上的重大損失。對此，研究者們研究出了如抗菌肽、中草藥提取物、益生菌、后生元等添加劑，用以提高水產動物機體的免疫力與抗病力，以減少病害發生。其中，益生菌類產品因其高安全性、低成本、應用廣泛等優點而受到廣泛青睞。水產養殖中的益生菌是一類對養殖動物和養殖水體有益的微生物的總稱。微生物發酵飼料是在人為控制下利用有益微生物對飼料底物進行發酵的過程，能夠改變飼料的營養特性、增強適口性、提高飼料的利用率和改善養殖水環境。近年來，世界魚粉資源短缺，價格持續上漲，植物蛋白質源在水產飼料中的占比逐漸增加。植物蛋白質源含有的纖維素和抗營養因子(ANFs)會降低水產動物的消化吸收能力，甚至引發腸炎問題，而通過生物發酵技術降低抗營養因子含量被證明是高效且安全的一種方式。益生菌在發酵過程中可對底物進行“預消化”，通過自身代謝活動減少底物中單寧、植酸、游離棉酚和硫甙等抗營養因子的含量，同時增加可溶性蛋白、酸溶性蛋白和小肽等營養物質的含量。另外，研究表明，微生物在發酵過程中可以分解膳食纖維，產生多種小分子糖類，有利于腸道微生物的生長，并且微生物在水產動物腸道生長過程中可產生短鏈脂肪酸(SCFAs)，能夠上調抗炎因子的表達水平，增強腸道化學屏障功能。發酵飼料的應用能為水產養殖業高質量發展提供堅實的保障。本文就發酵飼料的作用機理、發酵菌種的選擇、在水產養殖中的應用以及應用前景進行綜述，以期為發酵飼料在水產養殖中的應用提供參考。 發酵過程中，益生菌通過降解抗營養因子、釋放營養物質途徑實現對發酵底物的“預消化”。研究表明，解淀粉芽孢桿菌JY-24通過液體發酵可顯著提高辣木葉(Moringa oleifera Lam.)中蛋白質，總酚、黃酮、小肽含量(分別提高了24.53%、82.81%、58.58%和38.63%)，同時使單寧含量降低8.4%；復合菌發酵日本沼蝦基礎飼料可顯著增加飼料中芽孢桿菌、乳桿菌的數量，增加飼料中消化酶活性以及可溶蛋白、小肽營養物質含量，改善飼料風味；芽孢桿菌發酵豆粕可使蛋白質含量提高6.1%，β-伴大豆球蛋白(β-conglycinin)含量降低 58%；使用鼠李糖乳桿菌發酵麩皮時，發酵麩皮中總蛋白質、總碳水化合物、總酚類和總黃酮類含量明顯高于未發酵麥麩，同時降低了植酸含量(從4.20%減少到0.07%) ；Vo 等對花生種子進行不同處理：20kg花生種子在25～27℃、90%相對濕度條件下，每6h用33～37℃水浸泡1次進行發芽(發芽法)；20kg花生種子在90 ℃下蒸煮2h，然后磨碎至約50μm榨油(物理萃取法)；取1/2榨油后的花生粕用嗜酸乳桿菌( Lactobacillus acidophilus)在37℃下發酵72 h(發酵法)，結果顯示，發酵法和發芽法降解花生粕單寧酸和生物堿能力優于物理萃取法，且發酵法對單寧酸的降低率明顯高于發芽法。水產動物在攝食發酵飼料后，飼料中富含的益生菌在腸道內與致病菌爭奪腸道內的生態位產生競爭關系，從而降低致病菌的豐度。除此之外，厭氧生長的益生菌(如酵母菌、芽孢桿菌等)在腸道內生長會消耗氧氣、代謝產生乳酸等，在水產動物腸道內制造酸性低氧環境，可抑制有害微生物生長，并為厭氧有益菌創造良好的生存環境。同時，益生菌在發酵過程產生代謝產物和抗菌物質(如有機酸、過氧化氫和細菌素)，這些代謝產物能夠抑制嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila ) 和弧菌等有害菌的生長繁殖，調節水產動物腸道內的微生態平衡。發酵過程中微生物能代謝產生消化酶(淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、纖維素酶)和營養因子(B族維生素、小肽等)，輔助水產動物消化吸收飼料中的營養物質。此外，飼料在發酵過程中，大分子蛋白質可被微生物通過代謝活動降解為多肽類物質，部分多肽類物質具有較高的抗氧化活性，能夠增強水產動物的免疫力與健康，促進生長。發酵飼料的核心之一就是發酵菌種，各種類型的微生物，包括細菌、酵母和真菌已在飼料發酵過程中廣泛使用。乳桿菌在水產養殖中得到了廣泛的關注，包括植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum)、嗜酸乳桿菌、干酪乳桿菌(Lactobacillus casei)、副干酪乳桿菌(Lactobacillus paracasei)、保加利亞乳桿菌( Lactobasillus bulgaricus)、鼠李糖乳桿菌（Lactobacillus rhamnosus )等。乳桿菌在發酵過程中不僅可以降低發酵底物的pH，還能夠降低胰蛋白酶抑制因子等抗營養因子含量，產生消化酶、超氧化物歧化酶、乳酸和檸檬酸等，促進蛋白質水解，釋放游離氨基酸。厲桓研究發現，植物乳桿菌與黃芪粉1：1固態發酵7d可降解黃芪大分子蛋白質，增加半乳糖苷酶含量。董奇奇等研究發現，在乳上清液中添加1%～5%鼠李糖乳桿菌發酵20h，可提高Caco-2細胞核因子E2相關因子2(Nrf2)/醌氧化還原酶1(NQO1)信號通路表達，緩解脂多糖(LPS)誘導的氧化應激，降低炎癥反應和腸上皮細胞間通透性，改善腸道屏障。在水產養殖中，芽孢桿菌是研究最多的與宿主相關的細菌，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)、凝結芽孢桿菌(Bacillus coagulans)。這主要是由于芽孢桿菌獨特的能力，在水產動物腸道中生長可分泌多種消化酶，并保持腸道處于厭氧環境，有效抑制致病菌的生長，提高水產動物免疫力和對致病菌的抵抗力。此外，芽孢桿菌在發酵過程中能降低飼料中的抗營養因子，產生B族維生素(尤其是維生素B12和生物素)，提高了飼料的營養價值。另有研究表明，芽孢桿菌還可改善水質，降低水體中致病菌的豐度。釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、產朊假絲酵母(Candida utilis)、熱帶假絲酵母(Candida tropicalis)、紅酵母屬(Rhodotorula)、畢赤酵母屬(Pichia)等酵母菌使用歷史悠久，作為最早用于發酵的益生菌，其功能性產物包括β-葡聚糖、甘露寡糖和幾丁質，另外還可代謝產生酶、低聚糖、氨基酸、肽、有機酸、維生素和其他可溶性因子。姜燕等研究表明，使用釀酒酵母發酵刺參飼料可產生乙醇，使飼料具有獨特的風味，增加飼料的誘食效果，同時增加飼料中可消化蛋白質含量，改善飼料品質。腸球菌是人類和一些動物腸道微生物區系中的一員。研究表明，屎腸球菌可改善羅非魚(Oreochromis niloticu)的生長性能，增強免疫反應，增加血清補體3(C3)含量和髓過氧化物酶活性：提高歐洲鰻鱺(Anguilla anguilla )和褐牙鲆( Paralichthys olivaceus )的免疫能力并抑制由愛德華氏菌和鏈球菌引起的機體感染。楊成等研究表明，屎腸球菌以25%接種量發酵玉米粉24h可顯著降低發酵底物pH，增加乙酸含量。Shi等研究表明，先用枯草芽孢桿菌再用糞腸球菌進行發酵，可顯著降解豆粕中的抗營養因子含量，增加小肽和游離氨基酸的含量。木霉菌可產生多種具有生物活性的酶系，如纖維素酶、幾丁質酶、植酸酶、木聚糖酶等，可降解結構復雜的多糖和木質素，使與木質素鉸鏈在一起的纖維素和半纖維素游離出來，并進一步降解為多糖和單糖。木霉菌是纖維素酶的主要生產菌，在生產生物燃料、制造紙漿、釀酒等產業中被廣泛應用，主要研究對象是里氏木霉(Trichoderma reesei)。隨著世界魚粉資源短缺，植物蛋白質源被大量引入到飼料中，而植物蛋白質的細胞壁含有纖維素、木質素和半纖維素等，影響了水產動物對飼料的消化利用率，且攝食過多纖維素、木質素和半纖維素等會降低水產動物的攝食效率，引發機體炎癥反應，降低生長性能。纖維素酶能夠破壞植物細胞壁，釋放營養物質，提高草魚(Ctenopharyngodon idella)腸道消化酶活性，增加腸道絨毛高度和杯狀細胞數量，保護腸道健康。孫亞楠等研究發現，在菊芋渣表面噴灑0.1%里氏木霉發酵2個月可增加粗蛋白質和粗灰分含量，改善菊芋渣的營養組成。刑勝利等對里氏木霉的發酵條件進行了優化，在發酵5d后菌體菌絲大量增長，纖維素酶活性不斷提高，可高效降解玉米秸稈中的半纖維素和纖維素，產生葡萄糖、阿拉伯糖等。 基因工程菌是指將目的基因片段導入細菌體內使其表達，產生所需要的功能的細菌，其核心技術是DNA的重組技術。針對菌種益生性能，可以根據自身需求運用基因工程技術篩選出符合需求的菌種，例如，何錫杲通過基因工程技術將植酸酶基因導入畢赤酵母中得到高產植酸酶菌種，產酶量比優化前提高15%；Zhao 等通過CRISPR/Cas9技術得到1株高產淀粉酶的芽孢桿菌，淀粉酶產量提高22%。發酵方式主要包括單菌發酵、復合菌發酵和菌酶協同發酵，在生產中，多數研究集中在復合菌發酵以及菌酶協同發酵。復合菌發酵即是用2種及以上的有益微生物按照不同比例對底物進行發酵，微生物間可產生協同效應。范陽等根據發酵后豆渣的pH、益生菌數量、還原糖含量、氨態氮濃度等指標，篩選出最適的混菌比例、接種量、水分、發酵溫度和發酵時間，確定了混菌發酵豆渣的最優工藝。菌酶協同發酵即在益生菌基礎上添加酶制劑協同發酵，菌酶協同發酵的效果優于單純使用菌種發酵。研究表明，利用復合菌(枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌)與中性蛋白酶協同發酵豆粕，該發酵豆粕替代魚粉比例小于20%時對大口黑鱸(Micropterus salmoides)的生長沒有產生顯著影響；復合菌(枯草芽孢桿菌，釀酒酵母和植物乳桿菌)與0.1%植酸酶協同發酵可改善菜籽粕的品質；枯草芽孢桿菌BJ-1與木瓜蛋白酶等協同發酵可增加棉籽粕的粗蛋白質和氨基酸含量，同時降低粗纖維和游離棉酚含量，提高棉籽粕的品質。與傳統飼料相比，水產動物更易吸收發酵飼料中的營養物質。Das等研究表明，通過混合菌株(釀酒酵母和枯草芽孢桿菌)固態發酵麻油餅可增加其粗蛋白質含量，降低粗纖維以及單寧、皂苷等抗營養因子含量，發酵麻油餅替代飼料中20%的豆粕可顯著提高露斯塔野鱗(Labeo rohita)的生長性能、飼料轉化率和營養物質的消化率；在飼料中添加20～50g/kg嗜酸乳桿菌和釀酒酵母固體發酵滸苔(Enteromorpha prolifera)能顯著提高紅羅非魚(Oreochromis mossambicusxOreochromis niloticus)的增重百分比和特定生長率，降低飼料系數，提高了肝臟和腸道蛋白酶以及淀粉酶活性，增強消化性能；在基礎飼料中添加5%～10%發酵飼料能顯著提高斑點叉尾鮰(Silurus punctatus)的終末體重、特定生長率和蛋白質效率，改善魚體肌肉營養組成；在配合飼料基礎上額外添加日投喂量5%～20%的發酵飼料可顯著提高中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis)的存活率、增重率和特定生長率。 值得注意的是，發酵飼料在基礎飼料中比例過大可能無積極效果，甚至影響動物生長與健康。例如，Das 等用發酵油餅替代40%豆粕，露斯塔野鱗的生長性能、營養物質消化率和免疫參數與對照組無顯著差異；蔡潤佳等的研究結果證實，全部飼喂發酵飼料組的蛋白質利用效率要低于基礎飼料組；陳曉瑛等研究發現，飼糧中發酵豆粕替代超過20%魚粉后會顯著降低大口黑鱸的終末體重、特定生長率和攝食率。分析原因可能是因為發酵飼料一般含有較多水分，導致攝食的營養物質不足。由此可見，要酌情分析發酵飼料和基礎飼料間的比例，發酵飼料占基礎飼料的比例應在 30%以下。水產動物攝食發酵飼料后，飼料中被釋放的活性物質可調控水產動物的免疫與健康。研究表明，攝食發酵飼料能提高鯉魚(Cyprinus carpio)幼魚血漿中皮質醇和C3含量，且對機體的抗氧化能力沒有負面影響。使用發酵辣木葉替代飼料中40%～60%的魚粉可顯著提高異育銀鯽(Carassius auratus gibelio)血清中免疫酶、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、溶菌酶(LZM)活性和 C3含量，降低丙二醛(MDA)含量，抑制脾臟Toll 樣受體2(TLR2)和腫瘤壞死因子-a(TNF-a)信號通路表達，提高對嗜水氣單胞菌的耐受性。飼料中添加20%～30%的微生物發酵劑能顯著提升羅氏沼蝦(Macrobrachium rosenbergii)肝胰腺中SOD活性。另外，一些發酵植物和動物成分作為飼料添加劑也可提高水產動物的免疫力。例如，在飼料中添加1%～3%發酵檸檬皮、3 mg/kg植物乳桿菌發酵的生物硒、0.2%～0.8%發酵開菲爾、2.5%發酵蚯蚓可分別提高南美白對蝦、日本囊對蝦(Marsupenaeus japonicas)、斑馬魚等水產動物的非特異性免疫能力、抗氧化能力及抗病力。保護水產動物腸道健康是發酵飼料的重要功能。一方面，動物在攝食發酵飼料后，有益菌在腸道定植與致病菌爭奪生態位，并分泌抗菌肽、細菌素等抑制致病菌繁殖，達到改善動物腸道菌群結構的目的。研究發現，飼喂發酵飼料能提高凡納濱對蝦腸道厚壁菌門、擬桿菌門、芽孢桿菌屬和乳桿菌屬的豐度，降低弧菌屬的豐度。葛玲瑞等研究表明，草金魚(Carassius auratus redvar)攝食經過酵母菌和芽孢桿菌發酵后的飼料，腸道雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)的豐度顯著增加；陳李婷研究證明，發酵飼料可提高田螺(Cipangopaludina chinensis Gray)腸道中厚壁菌門的豐度和腸道物種多樣性。另一方面，益生菌在腸道定植后分泌的代謝產物如SCFAs、乳酸等，被證明可修復宿主腸道黏膜，構建腸道屏障，提高宿主對病原菌的抵抗力。韓瑞玲等研究表明，攝食發酵飼料可增加凡納濱對蝦腸道絨毛高度，使腸上皮細胞絨毛排列更為整齊、緊密。晏明瑤等研究發現，克氏原螯蝦(Procambarus clarkii)幼體攝食發酵飼料后腸道皺襞高度和橫截面積顯著增加。 發酵飼料在改善養殖水體方面也有突出的表現。近年來，水產養殖密度不斷增大，隨之而來的水環境問題日益突出，究其原因是傳統飼料中的蛋白質供給量遠遠超過水產動物本身的需求量，養殖動物未吸收利用的蛋白質隨排泄廢物一起排出體外，水體中氮、磷元素的不斷累積，導致水體環境惡化。多數養殖戶在水質惡化時進行換水或潑灑化學藥物，但只能緩解一時，且換水及化學藥物易引起水產動物應激反應，而微生物發酵飼料中的益生菌可代謝產生氨基轉移酶等，對水體中的污染物起到分解作用，大幅度降低水質污染。王天神研究表明，投喂發酵飼料的試驗組養殖水體pH和亞硝酸鹽含量均低于對照組；王鳳軍等研究發現，在養殖第7天發酵飼料組養殖水體的氨氮和亞硝酸鹽含量顯著低于未發酵組。表1列舉了在水產養殖中常用的發酵菌種制備的發酵飼料的品質改善情況，以及發酵飼料對養殖動物的影響。通過表1可知，益生菌通過分解抗營養因子，增加可消化蛋白質、消化酶活性等，改善水產動物的攝食，提高飼料利用率。表1 發酵對飼料品質的影響及發酵飼料對養殖動物的影響
DPPH:1，1-二苯基-2-苦基肼1；ABTS；2，2'-聯氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸；FBW:末體重；FL:末體長；WG:增重；WGR:增重率；FCR:飼料系數；SGR:特定生長率；ZO-1:閉鎖小帶蛋白；Z0-2:閉鎖小帶蛋白；SOD:超氧化物歧化酶；MDA:丙二醛；AST:谷草轉氨酶；ALT:谷丙轉氨酶；GSH:谷胱甘肽；T-AOC:總抗氧化能力；LZM:溶菌酶；ACP:酸性磷酸酶；AKP:堿性磷酸酶；GSH-Px:谷胱甘肽過氧化物酶；CAT:過氧化氫酶；IL-10:白細胞介素；IL-Iβ:白細胞介素-1β；1L-15:白細胞介素-15；IL-8:白細胞介素-8；TNF-a:腫瘤壞死因子-a；TNF-β。發酵飼料在水產養殖中的益生作用愈發突出，發酵飼料產生的營養、生物和化學屏障不僅可以提高水產養殖的產量，還可以改善水產品的品質，實現雙贏的效果。但是當前發酵飼料還處于發展階段，技術條件不是很成熟，還存在較多問題。首先，發酵飼料缺乏統一的生產標準以及評價標準，難以突出發酵飼料的產品特點；其次，發酵菌種主要從動物腸道或者自然界如土壤中分離純化得到，對菌種的研究不夠深入，在使用前需要對其進行安全性評估。另外，發酵飼料缺乏廣泛的宣傳及技術支持，養殖戶對發酵飼料的認識不足并且缺乏技術指導，導致發酵飼料得不到廣泛應用。因此，發酵飼料仍然有很大的發展空間，需要科研人員結合實際水產養殖的需求以及要求，選擇正確的菌種，為養殖戶提供持續的技術支持，推動發酵飼料在水產養殖中的應用。
參考文獻：略
作者：李正中、邵鵬等發表于《動物營養學報》2024年第8期。
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